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實(shí)驗(yàn)原理

分子生物研究中，zui常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機(jī)引物合成法。
切口平移法(nick translation) 當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時(shí)該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3'端補(bǔ)上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng),用放射性核苷酸代替原先無(wú)放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小ui合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。

實(shí)驗(yàn)試劑

(1) 10×切口平移緩沖液:  0.5M/L Tris-Cl (pH7.2)；  0.1M/L MgSO4； 10mM/L DTT；  100ug/ml BSA。

(2) 未標(biāo)記的dNTP原液：除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mM/L。

(3) [α-³²P] dCTP或[α-³²P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。

(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ：(4單位/ul)：溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。

(5) DNA酶:1mg/ml。

(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。

       (7) 10M/L NH₄Ac。

實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 按下列配比混合:

　　　　未標(biāo)記的dNTP 10ul

　　　　10×切口平移緩沖液 5ul

　　　　待標(biāo)記的DNA 1ug

　　　　[α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul

　　　　E.coli DNA聚合酶 4單位

　　　　DAN酶 I 1ul

　　　　加水至終體積 50ul

 (2) 置于15℃水浴60分鐘。

 (3) 加入5ul EDTA終止反應(yīng)。

    (4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5M/L, 加入兩倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀回收DNA探針。

注意事項(xiàng)

   1、³H，³²P及³⁵S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用[α^-32 P]-dNTP。

　2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長(zhǎng)度比較短。