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構(gòu)建全長cDNA文庫分為噬菌體文庫和質(zhì)粒文庫，二者大同小異。無論怎樣，應(yīng)當(dāng)注意如下幾個方面：

 

構(gòu)建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這比直接采用總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而構(gòu)建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中級柱子要求純化后的總mRNA量在0.05-0.5微克左右，這就要求起始總RNA量較多。雖然有的試劑盒聲稱少至幾十個納克的總RNA也可以構(gòu)建cDNA文庫，但這是針對材料極為稀缺者而言，但起始RNA太少還是會或多或少影響文庫構(gòu)建成功的風(fēng)險和文庫的代表性。至于RNA的質(zhì)量，如果采用純化總mRNA后反轉(zhuǎn)錄，則對總RNA的雜質(zhì)方面要求稍松，但對RNA的完整性則一絲不茍，要求未降解。如果直接采用總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，則對總RNA的質(zhì)量要求非常高，不僅要求RNA相當(dāng)完整而無降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、鹽、異硫氰酸胍等雜質(zhì)少，是試劑盒抽提的。

 

這是構(gòu)建cDNA文庫中zui貴的一步，也是核酸質(zhì)變的一步，它將易降解的RNA變成了不易降解的cDNA。反轉(zhuǎn)錄不成功，說明一次文庫方案的夭折。反轉(zhuǎn)錄效率不高表現(xiàn)在一是部分mRNA被反轉(zhuǎn)錄了，但還有相當(dāng)一部分本該反轉(zhuǎn)錄的mRNA未被反轉(zhuǎn)；二是只有少部分mRNA被反轉(zhuǎn)錄通了即達(dá)到帽子結(jié)構(gòu)zui近處，而很大一部分mRNA沒有反轉(zhuǎn)錄*，總的全長cDNA太少，這就難以構(gòu)建好的全長cDNA文庫。少量程度的mRNA降解或反轉(zhuǎn)錄不*在SMART 4等試劑盒及手工方法構(gòu)建中對文庫的滴度影響不大，但對文庫的全長性則有很大影響。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接頭連接后再反轉(zhuǎn)錄的新技術(shù)（可參考其GeneRacer說明書）從原理上是保證zui終獲得全長cDNA的方法，但對mRNA的完整性要求非常高，理論上講必須是帶有帽子結(jié)構(gòu)和Poly A結(jié)構(gòu)的全長mRNA且反轉(zhuǎn)錄*，才能進(jìn)入文庫中。反轉(zhuǎn)錄完成后點(diǎn)樣檢測cDNA的濃度及分子量分布是很重要的。

 

這一步稍不注意會影響成功性或影響獲得的cDNA的片段分布特點(diǎn)。這一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通過反復(fù)懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。獲得的每一級的cDNA量很少，檢測時帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測，根據(jù)檢測結(jié)果一定要舍棄太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因為短片段太多會嚴(yán)重影響后面的連接轉(zhuǎn)化效果及文庫質(zhì)量）。

 

噬菌體文庫或質(zhì)粒文庫均對載體與cDNA的連接效率要求很高，也對連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率要求很高。連接效率高低直接關(guān)系到文庫構(gòu)建是否成功，更要注意的是文庫連接與一般的片段克隆的連接不一樣。一般的片段克隆連接是固定長度的載體與固定長度的目的DNA連接，而文庫連接是固定長度的載體與非固定長度的目的DNA連接，目的基因cDNA長的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列長度不等的cDNA與載體在一起連接的結(jié)果，不同長度cDNA的連接效率就不一樣。有的專家的經(jīng)驗是，根據(jù)分級結(jié)果，有意識地將長度不同的cDNA群分別與載體連接，再分別轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染大腸桿菌，分別完成滴度檢測，zui后將不同長度級別的文庫混合在一起供雜交篩選。

cDNA雙鏈合成

1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入

xul mRNA（大約500ng）

1ul Xho I Primer（1.4ug/ul）

（5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’）

11-x ul RNase-free water

（大于500ng mRNA 分n管（500ng/tube）合成*鏈, *鏈合成完畢后將n管合成一管進(jìn)行第二鏈合成.）

2. 混勻后,70℃反應(yīng)10分鐘;

3. 反應(yīng)完成后,立刻將反應(yīng)體系置于冰上5min;

4. 稍微離心一下,順序加入以下試劑:

4ul 5×first strand buffer

2ul 0.1M DTT

1ul 10mM dNTP（自己配制）

5. 混勻，稍微離心反應(yīng)物之后,42℃放置2分鐘;

6. 反應(yīng)完成,趁熱加入1 ul Superscipt II—RT,混勻;

7. 42℃反應(yīng)50分鐘,然后70℃,15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶.
 

1. *鏈反應(yīng)完成后,取2ul一鏈產(chǎn)物－20℃冰箱中保存，待電泳檢測。其余的產(chǎn)物合并，混勻，然后順序加入下列試劑（promega）:

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP（自己配制）

xul dd H2O

1ul RNase H（2U/ul）

10ul DNA Polymerase I（10U/ul）

總體系為200ul;

2. 混勻后,16℃反應(yīng)2.5小時;

3. 70℃滅活10分鐘;

4. 反應(yīng)完成后,得到200ul cDNA第二鏈反應(yīng)體系,將此體系置于冰上;

5．取2ul二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一起電泳鑒定。同時上1kb ladder，確定雙鏈的大小范圍。

注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear，且二鏈稍比一鏈大一些。
 

1. 在第二鏈反應(yīng)體系中,順序加入下列試劑（promega）:

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase（8.7U/ul）

2ul BSA（10mg/ml）

2. 稍微離心混勻反應(yīng)物, 37℃反應(yīng)至少30分鐘,然后75℃滅活10分鐘;

3. 加入等體積酚/氯仿/異戊醇,劇烈振蕩后,常溫下13000g離心5分鐘;

4. 離心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等體積氯仿,上下顛倒幾次混勻后,常溫下13000g離心5分鐘;

5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc（PH5.2）和2.5V預(yù)冷的無水乙醇,混勻,-20℃放置以沉淀雙鏈cDNA;

6. 第二日,將昨日沉淀物在4℃,13000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA;

7.離心完畢,棄上清,加入1ml 70%乙醇洗滌沉淀,常溫下13000g離心5分鐘;

8.離心完畢,棄上清,干燥沉淀至無乙醇?xì)馕?

注：第3，第4步可以用PCR 純化試劑盒代替。

PCR純化試劑盒操作流程：

1．溶液PE使用前應(yīng)加入適量體積95%－100%的乙醇，混勻。

2．向200ul二鏈補(bǔ)平產(chǎn)物中加入5倍體積的buffer PB，混勻。

3．加入spin column中，13000rpm離心1min。

4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm離心1min。

5．13000rpm，再離心1min。

6．將spin column放入一新的離心管中，加入50ul buffer EB，靜置10min。

7．13000rpm離心2min。

8．加入30ul buffer EB，靜置10min。

9．13000rpm離心2min。

10．加入1/10體積3M的NaAc，2.5倍體積無水乙醇，混勻，－20℃沉淀。
 

1. 往雙鏈cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor（400ng/ul）,4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀;

2. 溶解完成后,順序加入下列試劑:

1.2ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase（4U/ul）

3. 混勻后,4℃連接3days,或者8℃連接;
 

1. 連接反應(yīng)完成后,將反應(yīng)體系70℃放置15分鐘滅活T4 DNA Ligase;

2. 稍微離心使反應(yīng)物集中至管底,室溫下放置5分鐘,然后加入下列試劑:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2O

1ul T4 PNK（10U/ul）

3. 37℃反應(yīng)30分鐘,然后70℃滅活15分鐘;

4. 稍微離心使反應(yīng)物集中至管底;

5. 室溫放置5分鐘;然后加入下列試劑:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I （10U/ul）

6. 37℃反應(yīng)1.5小時,然后65℃滅活酶10分鐘;

7. 反應(yīng)完成,雙鏈cDNA合成完畢。置于4℃準(zhǔn)備回收。
 

1．配制小膠數(shù)板（每個樣品一板）：1%瓊脂糖凝膠，2ul EB/300ml 膠

2．取4℃保存樣品上樣，40ul/孔。

3．電泳50V；1hr

4．紫外燈下分別切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分別放入已做標(biāo)記的1.5ml離心管中。

5．稱取膠重，加入三倍體積buffer QXI（例如，100mg膠中加入300ul buffer QXI）

6．50℃ 水浴數(shù)分鐘，至膠*融化。用手指彈 QIAEX II 使重懸，每管中加入5ul QIAEXII

7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出顛倒混勻數(shù)次，使QIAEX II 保持懸浮

8．4℃，13000rpm，30sec。（棄上清，離心機(jī)中甩一下，吸取上清）

9．加入500ul buffer QXI，輕彈管底使QIAEX II 重懸

10． 離心并去上清（同操作8）

11． 加入500ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30sec，去上清

12． 再加入500ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30sec，棄上清，離心機(jī)中甩一下，吸去上清

13． 超凈臺上吹干（至無乙醇味），加入10ul elution buffer，重懸QIAEX II，靜置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14． 取1ul上清上樣電泳，同時做分子量標(biāo)準(zhǔn)（1kb ladder）及DNA含量標(biāo)準(zhǔn)（10ng，20ng）作對照。

15． 將收回的cDNA置于-20℃內(nèi)保存，據(jù)電泳結(jié)果，取適量DNA進(jìn)行連接。
 

1．膠回收前電泳槽，電泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡過