DNA專題：變性梯度凝膠電泳
更新時間：2013-07-22 瀏覽次數(shù)：1693
一、實驗原理
變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據(jù)DN段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng)。核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發(fā)生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設(shè)置在雙重變性條件下：溫度50~60 ℃，變性劑0~100%。當(dāng)一雙鏈DN段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當(dāng)于此段DNA的低熔點區(qū)的Tm值，此區(qū)便開始熔解，而高熔點區(qū)仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發(fā)生改變，達(dá)到分離的效果。Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變。
為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區(qū)——GC夾。GC夾（GC clamp）就是在一側(cè)引物的5′端加上一個30~40bp的GC結(jié)構(gòu)，這樣在PCR產(chǎn)物的一側(cè)可產(chǎn)生一個高熔點區(qū)，使相應(yīng)的感興趣的序列處于低熔點區(qū)而便于分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%。
作為一種突變檢測技術(shù)，DGGE具有如下的優(yōu)點：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達(dá)1kb，尤其適用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素?fù)饺?，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內(nèi)即可獲得結(jié)果。（5）重復(fù)性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。
二、實驗用品
1．PCR擴(kuò)增儀；變性梯度凝膠電泳儀；凝膠成像及分析系統(tǒng)；紫外透射儀；高速離心機(jī)；電泳儀；電泳槽。
2．尿素、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖
3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）。Tip頭盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
4．PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑
三、實驗步驟
1．PCR反應(yīng)（同前）
其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。
2．PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。
3．垂直變性梯度凝膠電泳
變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0～100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的zui適解鏈條件（即變性濃度）。
PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣，300～400μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間2～4小時。
4．平行變性梯度凝膠電泳
變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據(jù)垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區(qū)域的變性濃度，制備相應(yīng)變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標(biāo)本是否存在突變。
PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后，25μl～30μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間3～6小時。
5．染色5分鐘，凝膠成像儀分析結(jié)果。
四、注意事項
1、該實驗中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒，還有致癌、變性等毒害，一定要嚴(yán)格操作，做好防護(hù)保護(hù)自己。
2、嚴(yán)格按操作步驟。
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