IEF分離蛋白質(zhì)
更新時(shí)間：2015-12-04 瀏覽次數(shù)：2433
實(shí)驗(yàn)試劑
樣品提取液（8M尿素、2％非離子型去污劑NP－40、2％Ampholin，pH3.5-10、2％DTT）
膠母液 （30％的29/1的Acr/Bis），兩性電解質(zhì)
陽(yáng)極緩沖液 1M磷酸
陰極緩沖液 1M氫氧化鈉
固定液（10％的三氯、1％的磺基水楊酸）
染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍(lán)R250）
脫色液（35％乙醇、10％冰醋酸）
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
高壓電泳儀、IEF槽、離心機(jī)等
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 樣品提取
1) 1ml原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀
2) 沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解，離心取上清
2. 制膠
1) 安裝超薄膠裝置
2) 依次加入下述試劑
膠母液 2ml
尿素 8M /脫氣
NP－40 0.2ml
兩性電解質(zhì) 2ml
10%過(guò)硫酸胺 50ul
TEMED 5ul
3) 倒膠
3. 電泳
1) 預(yù)電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求，電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤(rùn)，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無(wú)氣泡）。
2) 將分別被陰陽(yáng)極緩沖液浸潤(rùn)的電極條置于膠面上將與陰陽(yáng)電極接觸的部位，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200V預(yù)電泳10min。
3) 電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預(yù)備點(diǎn)樣的膠面上，取10－15ul樣品液，點(diǎn)于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進(jìn)行電泳
4) 電泳參數(shù)
200V 30min，400V 30min，800V4hr
4. 染色
1) 固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10min.
2) 顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現(xiàn)。
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