動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)：轉(zhuǎn)基因小鼠制備實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2014-10-21 瀏覽次數(shù)：1377
1、 選取7~8周齡雌性小鼠，陰道口封閉，作為供體，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。
2、 47~48小時(shí)后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并與正常公鼠合籠；另取數(shù)只適齡母鼠（2月齡以上）作為受體，陰道口潮紅，與結(jié)扎公鼠合籠。
3、第二天上午9:00前觀察供體、受體，有精栓者拿出備用。受體籠拿出作好隔離措施。
4、10:30左右，斷頸處死供體，手術(shù)取出整個(gè)輸卵管，放入透明質(zhì)酸酶~0.3mg/M2液中。顯微鏡下，用鑷子撕開輸卵管壺腹部，受精卵隨同顆粒細(xì)胞即一同流出。
5、仔細(xì)觀察放在透明質(zhì)酸酶M2液中的受精卵，當(dāng)受精卵周圍的顆粒細(xì)胞脫離時(shí)，將受精卵吸出，放入M2液中洗滌，zui后放在M16液中放入5% CO2，37C0培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
6、在顯微鏡下觀察，挑選細(xì)胞飽滿，透明帶清晰，雄原核清晰可見的受精卵待用。
7、安裝持卵針和注射針，使其末端平行于載物臺(tái)，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆蓋石蠟油，移入待注射的受精卵。DNA在注射針中的氣泡應(yīng)在先前全部彈走。
8、在高倍鏡下，將注射針輕觸持卵管，使DNA緩慢流出并控制其流量；反復(fù)吹吸受精卵，使其處于*位置，將注射針刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。將注射過的和未注射過的受精卵上下分開放置，不致于混攪，注射完畢后，放入5% CO2，37C0培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
9、將受體麻醉，注射計(jì)量為1%戊巴比妥鈉0.01ml/g，腹腔注射。手術(shù)取出卵巢連接輸卵管，用脂肪鑷固定，在顯微鏡下找到輸卵管開口。吸取注射后經(jīng)培養(yǎng)成活的受精卵，吸取方法是先吸一段較長的M2，吸一個(gè)氣泡，然后吸取受精卵，盡量緊密排列，再吸一段液體，吸一個(gè)氣泡，再吸一段液體，共四段液體三個(gè)氣泡。除較長的那段液體，其余的液體大致1cm左右，氣泡0.2cm左右。將移植管口插入輸卵管口，輕輕將移植管內(nèi)的液體吹入，看到輸卵管壺腹部膨大并清晰地看到三個(gè)氣泡，即移植成功。將卵巢連同輸卵管放回腹腔，縫合肌肉和皮膚。
10、受體每隔一個(gè)星期稱體重一次，當(dāng)?shù)诙伪?次稱重增加時(shí)，即可初步判斷懷孕。手術(shù)后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、編號(hào)，剪尾，交分子組檢測。
(一般選取4-5周齡的雌鼠作為供體，此時(shí)的小鼠卵數(shù)較多，狀態(tài)較好。用pms誘導(dǎo)卵細(xì)胞成熟，用hcg超排。)