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小鼠

中性福爾馬林固定液 酒精 二甲苯 石蠟 蜂蠟 蘇木精染液 伊紅酒精溶液 鹽酸酒精溶液 甘油蛋白粘片劑 中性樹膠 卡諾固定液

切片機 恒溫箱 蠟杯 酒精燈 解剖剪 培養(yǎng)皿 鑷子 單面刀片 包埋盒 染色缸 蓋玻片 載玻片 玻片盤 顯微鏡 溫度計 水浴鍋

一、材料準備：

1.  中性甲醛固定液：

甲醛（37%-40%，市售，本所購買即為此濃度）100 mL

磷酸氫二鈉6.5 g

磷酸二氫鉀（鈉）4 g

雙蒸水900 mL

2.  1%鹽酸乙醇液：

鹽酸1份

70%酒精100份

3.  甘油蛋白貼片劑：

蛋白50 ml

甘油50 ml

水楊酸鈉（防腐劑）1 g

4.  配制

（1）將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫。

（2）然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。

（3）此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。

（4）zui后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可保存幾個月。

二、實驗步驟：

1.  取材

（1）頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。

（2）切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5 mm×5 mm×2 mm或10 mm×10 mm×2 mm 為宜。

（3）取下所需要的肝組織，切成一小塊2~3 mm 厚。

2.  固定

（1）將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下

（2）立即投入中性福爾馬林固定液中固定

（3）固定30~50 min。

3.  洗滌

材料經(jīng)固定后，流水沖洗，數(shù)小時或過。

4.  脫水

（1）材料依次經(jīng)70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30 min。

（2）再放入95%、100%各2次，每次20 min。

5.  透明

（1）純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明為止）。

（2）由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。

（3）當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。

6.  透蠟

（1）放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50~60分鐘。

（2）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織大小而定。

（3）透蠟應在恒溫箱內進行，并保持箱內溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5 h。

7.  包埋

（1）包埋時，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上。

（2）從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。

（3）再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟模中，排列整齊。

（4）再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。

8.  切片

（1）將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。

（2）將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。

（3）搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。

（4）調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。

（5）調整厚度調節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。

（6）一切調整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40~50 r/min。

（7）切成的蠟帶到20~30 cm 長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。

（8）用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。

（9）切片工作結束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。

9.  展片、貼片

打開水浴鍋，使水溫維持在40~45℃，另準備30%乙醇溶液。

（1）切片時，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。

（2）用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。

（3）小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。

（4）另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標記或貼上標簽，放于切片架上。

10.  脫蠟復水

（1）將水浴鍋溫度調至60℃，待水溫控制在60℃時。

（2）將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30 min 至蠟熔化。

（3）之后，石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3~5 min，再放入蒸餾水中3 min。

11.  染色

（1）切片放入蘇木精中染色約10~30 min。

（2）染色時間應根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。

（3）室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。

12.  水洗

（1）用自來水流水沖洗約15 min。

（2）使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可）。

（3）但要注意流水不能過大，以防切片脫落。

13.  分化

（1）將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色。

（2）約2秒至數(shù)十秒鐘，見切片變紅，顏色較淺即可。

14.  漂洗

切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。

15.  脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5 min。

16.  復染

（1）用0.5%伊紅乙醇液對比染色1~3 min。

（2）伊紅主要染細胞質，著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。

（3）反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。

17.  脫水Ⅱ

（1）將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色。

（2）然后放入無水乙醇中3~5 min。

（3）zui后用吸水紙吸干多余的乙醇。

18.  透明

（1）切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min。

（2）二甲苯應盡量保持無水，應經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。

（3）切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。

19.  封藏：中性樹膠封存

因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。

20.  封藏的方法：

（1）封片前應根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。

（2）材料透明后，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上）。

（3）迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。

（4）如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。

（5）如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。

（6）染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

三、免疫組化染色

1.  石蠟切片，步驟同前。切片經(jīng)貼片后，60℃烤片30 min使蠟熔化，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，脫蠟。然后，將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3~5 min，再放入蒸餾水中3 min，水化。

2.  脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4，具體看所用抗體及染色試劑說明）沖洗3次，每次3分鐘。洗瓶沖洗。

3.  根據(jù)抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復?？蛇x步驟，具體見抗體說明書。

4.  每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對內源性過氧化物酶含量高的組織而言。

5.  除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 的*抗體，室溫下孵育60分鐘或4℃過，具體參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次，每次3分鐘。

6.  除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 即用型MaxVisionTM試劑或SP試劑，室溫下孵育10~15分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。

7.  除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3~5分鐘（DAB）或37℃環(huán)境下10~30分鐘（AEC）。

8.  自來水沖洗，蘇木素復染10分鐘，PBS或自來水沖洗返藍。如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，步驟同H-E染色，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

一、取材注意事項

1.  取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發(fā)生變化。

二、固定注意事項

1.  一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。

2.  有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。

3.  固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1~2次新液。

三、脫水注意事項

1.  脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。

2.  在更換高一級的脫水劑時，不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。

3.  在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。

4.  在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。

5.  如需過，應停留在70%酒精中。

四、透明注意事項

1.  使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。

2.  更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。

五、透蠟注意事項

1.  盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度。

2.  透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低。

3.  操作要迅速，力求在zui短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。