細(xì)胞技術(shù)專題：大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
更新時間：2014-02-25 瀏覽次數(shù)：1791
標(biāo)簽： 大鼠 腦微血管 內(nèi)皮細(xì)胞 原代培養(yǎng)
大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：（1）應(yīng)用于血腦屏障的研究；（2）腦血管疾病的病理生理及分子生物學(xué)研究；（3）新藥篩選；（4）腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞生理生化及藥理學(xué)研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 酶消化法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 丁香園站友參考文獻(xiàn)采用以大腦皮質(zhì)為材料、酶消化及梯度離心分離腦微血管段并進(jìn)行原代培養(yǎng),，成功地摸索出大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的方法，并獲得純度較高的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | SD大鼠 |
| 試劑、試劑盒 | 纖連蛋白 Ⅳ型膠原 明膠 肝素鈉 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 青霉素 鏈霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾膠 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型膠原酶 |
| 儀器、耗材 | 低溫離心機(jī) 離心管 移液槍 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1. 實(shí)驗(yàn)動物 每次實(shí)驗(yàn)采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。 纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原、鼠尾膠、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購自Sigma公司；D-Hanks'液、10×PBS按配方自制；II型膠原酶購自Worthington公司；明膠、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購自Amresco公司；Percoll 購自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)購自GIBCO/BRL公司；肝素鈉、NaHCO3購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；青、鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)購自PAA Laboratories；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購自Roche公司。 3. 儀器 低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810 R，購自Eppendorf；Himac CR 22F，購自Hitachi)。 4. 試劑配制 （1）1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制)，1%明膠(用D-Hanks'液配制)，1%II型膠原酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%的濃度)，1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，調(diào)pH值至7.4后用0.45 μm濾膜過濾除菌，較難過濾)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/μl)，以上試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20℃。 二、培養(yǎng)皿預(yù)處理 1. 涂布3種不同的基質(zhì)，培養(yǎng)前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱，接種前用D-Hanks'液漂洗2次。 三、 腦微血管段的分離與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 1. 大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養(yǎng)皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。
四、鑒定方法 形態(tài)學(xué)、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測。 五、 結(jié)果 1. 細(xì)胞形態(tài)觀察 接種當(dāng)時可見由圓形的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段，并可見散在的單細(xì)胞及組織碎片(見圖1-1)；培養(yǎng)12~24 h后可見培養(yǎng)的細(xì)胞從貼壁的微血管段周圍長出，細(xì)胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長，經(jīng)換液后微血管段的殘余部分不斷減少，成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞等雜細(xì)胞含量較少；隨著培養(yǎng)時間的延長，內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖，可見"漩渦"分布，大約5~7天細(xì)胞達(dá)到融合，短梭形的內(nèi)皮細(xì)胞占90%以上，但可見少量周細(xì)胞等雜細(xì)胞生長于內(nèi)皮細(xì)胞單層表面或細(xì)胞克隆間隙(結(jié)果未顯示)。細(xì)胞生長過程見圖1，細(xì)胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿。 2. 涂布不同基質(zhì)的細(xì)胞生長情況 明膠及鼠尾膠涂布的培養(yǎng)皿微血管段貼壁時間較長，6 h時可見少量微血管段貼壁但無內(nèi)皮細(xì)胞長出，12~24 h可見一些內(nèi)皮細(xì)胞長出，24 h后腦微血管段*貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長出，兩者無明顯差異(見圖2-1~4)；纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿培養(yǎng)后6 h即可見微血管段貼壁并有一些內(nèi)皮細(xì)胞長出，12~24 h內(nèi)基本*貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長出(見圖2-5,6)。 3. 免疫組化鑒定 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測可見培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿及核周有棕黃色著色，胞核呈空泡狀結(jié)構(gòu)；對照染色為陰性。 收起 |
| 其他 | 一、實(shí)驗(yàn)討論 我們采用兩次酶消化、梯度離心分離得到腦微血管段，探索各種不同的培養(yǎng)條件，成功地進(jìn)行了較純的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，而且細(xì)胞得率較高，10只動物可培養(yǎng)8~10個35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿，培養(yǎng)面積大約80~100 cm2，與國內(nèi)的一些方法[3~5]相比，細(xì)胞得率有明顯的提高。 由于新生鼠易于混有較多的雜細(xì)胞且大腦較小以及哺乳期大鼠優(yōu)于超過1月齡的大鼠[9]，我們采用2~3- 12 - 丁香園細(xì)胞技術(shù)討論版電子文集 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)周齡哺乳期的SD大鼠作為培養(yǎng)材料。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵是首先分離獲得純度較高且活力好的腦微血管段。在解剖過程中仔細(xì)去除軟腦膜、大血管及大腦白質(zhì)收集大腦皮質(zhì)，可減少成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生長，對于提高內(nèi)皮細(xì)胞的純度具有重要意義。由于膠原酶對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷較小，我們采用0.1%Ⅱ型膠原酶消化剪碎后的大腦皮質(zhì)分散組織，同組織勻漿法[3,10]相比，酶消化法可避免組織勻漿對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而有利于提高細(xì)胞的活力。經(jīng)膠原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖離心可分離腦微血管段與神經(jīng)組織及大血管，得到底層的腦微血管段，這種方法被廣泛應(yīng)用于腦微血管段的分離[5~9,11,12]，我們發(fā)現(xiàn)20% BSA較15%葡聚糖而言，其分離獲得的腦微血管段數(shù)量更多，而且腦微血管段狀態(tài)更好更易貼壁生長。由于周細(xì)胞是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)中zui常見的雜細(xì)胞，它會明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長[7]，因此原代培養(yǎng)中應(yīng)盡量減少周細(xì)胞的數(shù)量，我們采用兩次酶消化方法[7]，控制兩次酶消化的時間，用0.1%膠原酶/消化酶分散出內(nèi)皮細(xì)胞外圍的周細(xì)胞，zui后采用一定濃度的連續(xù)梯度的Percoll分離以去除周細(xì)胞和紅細(xì)胞得到較純的腦微血管段。在酶消化過程中加入適量的DNA酶可分散消化過程中釋放的DNA所引起的微血管段凝結(jié)塊，有利于增加微血管段的得率。對于Percoll離心，我們嘗試了3個濃度(33%、45%及50%)后發(fā)現(xiàn)，濃度越大，腦微血管段離靠近離心管底的紅細(xì)胞及周細(xì)胞越遠(yuǎn)，分離效果也越好，因此采用50% Percoll效果，并且采用水平轉(zhuǎn)頭的低溫離心機(jī)以提高離心效果。內(nèi)皮細(xì)胞純化的其他方法有機(jī)械刮除法、克隆培養(yǎng)法、FACS分類法[13]、Thy1.1免疫反應(yīng)殺傷法[7,14]、采用血漿來源的胎牛血清[8]、磁珠結(jié)合法[10]等，但是我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械刮除法和克隆培養(yǎng)法并不適合大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的純化，因?yàn)樵鷥?nèi)皮細(xì)胞傳代后狀態(tài)不佳且易被雜細(xì)胞所抑制[7]，而后面幾種方法比較昂貴不予推薦；血漿來源的胎牛血清不含PDGF，不促進(jìn)雜細(xì)胞的生長，但是其較昂貴，可選擇胎牛血清用于原代培養(yǎng)。
腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)需要涂布明膠、鼠尾膠、纖連蛋白等基質(zhì)以利于腦微血管段貼壁和內(nèi)皮細(xì)胞的生長。我們嘗試不同基質(zhì)后發(fā)現(xiàn)其對腦微血管段的貼壁和內(nèi)皮細(xì)胞的生長作用不同，纖連蛋白/IV型膠原優(yōu)于鼠尾膠，而鼠尾膠比明膠好，而且接種密度的要求前者比后兩者要低，后兩者需要達(dá)到一定密度才有利于腦微血管段貼壁。另外我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞不易生長于玻片上，而較易生長于塑料培養(yǎng)皿上，這與文獻(xiàn)報道基本相符[8,14]。內(nèi)皮細(xì)胞生長需要添加內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制雜細(xì)胞的生長，我們采用bFGF可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長，同時添加100 μg/ml肝素協(xié)同bFGF的作用并可抑制平滑肌細(xì)胞的生長[9]。同時為了保證內(nèi)皮細(xì)胞的營養(yǎng)，并去除腦微血管段的殘余碎片，我們采用20% FBS的血清濃度并隔天換液。 我們培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長，隨著培養(yǎng)時間的延長及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，可見"漩渦狀"分布，約5~7天后，各區(qū)域之間可逐漸融合，其形態(tài)和生長特點(diǎn)與大多數(shù)文獻(xiàn)報道相似[6~9,11,12]。根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的短梭形的形態(tài)特點(diǎn)、Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)陽性可鑒定我們所培養(yǎng)的細(xì)胞確為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞[3,5,8]。 我們的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立，對于研究腦內(nèi)皮的生理、生化及藥理研究是一個較好的工具，同時可與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)用于構(gòu)建血腦屏障模型[1]。相信隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的模型將逐漸接近于其在體特征，并被廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究[1]。
參考文獻(xiàn) [1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287 [2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95 [3] 王建民等。解剖學(xué)雜志，1998，21：495 [4] 許彥鋼等。微循環(huán)技術(shù)雜志，1997，2：63 [5] 錢志遠(yuǎn)等。細(xì)胞生物學(xué)雜志，1999，21：42 [6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139 [7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1 [8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23 [9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312 [10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554 [11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435 [12] Ichikawa N et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 1996, 36：45 [13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269 [14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473 |
