蛋白質(zhì)技術專題：免疫球蛋白提取技術
更新時間：2013-12-03 瀏覽次數(shù)：1794
免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表著機體體液免疫的水平，并進一步代表著B細胞的功能，因此測定血清Ig含量可以推知機體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低。
隨著免疫學的發(fā)展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為*的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數(shù)采用二步法以上相結(jié)合的方法，特別是以硫酸銨提純?yōu)榛A，再經(jīng)過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度zui為常用。
硫酸銨溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來（稱為鹽析）。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同，利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提，為了獲得純化的免疫球蛋白成分，必須進一步采用層析的方法進行分離。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。
一、IgG的分離與提純
1、材料與試劑配制
（1）動物血清
（2）硫酸銨飽和溶液
硫酸銨800g~850g
H2O 1000ml
加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過濾，置室溫過，然后以28%NH4OH調(diào)pH至7.0（不調(diào)pH值也可以）。
注：硫酸銨以質(zhì)量優(yōu)者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質(zhì)巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過后濾過，加熱蒸發(fā)H2S即可。
（3）0.01Mol/L pH7.4PBS液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•；2H2O 15.60g
加H2O至1000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•；12H2O 35.80g
加H2O至1 000ml
取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
（4）1%BaCl2溶液
（5）納氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至500.00ml
溶化后過濾，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
（6）0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
（7）洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。
（8）透析袋（或玻璃紙）。
2、操作方法
（1）取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液10ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。
（2）3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。
（3）在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30min。
（4）3000r/min離心20min，棄上清。
（5）于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加（NH4）2SO4飽和溶液10ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。
（6）3000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2~3次。
（7）10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。
（8）除鹽，在常水中透析過，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次。
以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4 （取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現(xiàn)磚紅色即認為有NH4 存在），直至無SO42-或NH4 出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。
（9）離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。
（10）過DEAE－纖維素層析柱。（裝柱過程見層析技術）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
（11）蛋白質(zhì)及其定量鑒定。
（12）IgG的純度鑒定，可采用下列方法之一鑒定。
①玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可
加樣電泳后，只在γ—球蛋白的遷移部位出現(xiàn)一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度（NH4）2SO4鹽析樣品進行電泳，以資比較。
②瓊脂雙相雙擴散鑒定
預先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現(xiàn)一條沉淀線。
③免疫電泳鑒定
孔內(nèi)加待測樣品，電泳后，在槽內(nèi)加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結(jié)果。如果提取的IgG純的話，則只出現(xiàn)一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區(qū)。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。
④圓盤電泳鑒定
用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現(xiàn)數(shù)十條區(qū)帶，而純化的IgG則只有一條區(qū)帶。
（13）IgG的濃縮與保存
①IgG的濃縮
②IgG的保存
一般濃縮至1%以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復凍融。
3、IgG的簡易快速提取法
應用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG，不僅操作復雜、需時較長，處理過程中樣品體積大大增加，而且透析時變性嚴重，容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足，特別是當大量提取IgG時，則往往采取下列的簡易辦法。
（1）DEAE-纖維素直接提取法
取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是zui為簡單的燒杯法。
①以一定數(shù)量的DEAE52放入燒杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PBS緩沖液，靜置30min，去上清細粒，再重復一次。
②用布氏漏斗（內(nèi)放兩層濾紙）過濾。
③以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。
④于4℃中放置1h，中間攪拌數(shù)次。
⑤用布氏漏斗抽濾，再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素，抽濾。濾液即為提取的IgG液。
（2）DEAE－SephadexA－50為弱堿性陰離子交換劑，經(jīng)NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G屬中性蛋白外其余均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取γ－G。這種提取法流程大大縮短，純化前后樣品體積變化不大，而且所得γ－G無變性現(xiàn)象。經(jīng)過四次處理，其純度也較好。缺點是收集量少，損耗大。
①DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE－SephadexA－50若干克，懸浮于蒸餾水中，1h后傾去上層小顆粒，然后用0.50Mol/L NaOH處理1h，蒸餾水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h，水洗至中性，zui后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
②取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液體體積1/4的濾干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不時攪拌、抽濾、收集濾液。
③再用同樣重量的DEAE－SephadexA－50處理濾液。反復處理三次。（全程共四次）。獲得濾液即為γ－G制品。
④DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫，抽濾至濾液中無蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。
4、禽血清IgG的分離與提純（Na2SO4法）
（1）試劑
①5%葡聚糖硫酸鹽
②0.02Mol/L MnCl2溶液
③無水硫酸鈉
④pH8.2硼酸鹽緩沖液
⑤0.06Mol/L pH7.4PB液
（2）操作方法
①取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸鹽液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，靜置，然后離心去沉淀，此步目的是為了去掉脂類物質(zhì)。
②于上清液中加無水硫酸鈉使每毫升血清含0.18g，緩慢加入，混勻，靜置30min，3 000r/min離心去上清。
③以pH8.2硼酸鹽緩沖液將沉淀稀釋至原血清的一半再加硫酸鈉使成0.16g／ml，同上法離心去上清。
④重復步驟③，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
⑤以少量硼酸鹽緩沖液溶解沉淀，然后裝透析袋除鹽48h。
⑥過SephadexG200柱，收集*峰和第二峰。*峰是IgM，第二峰主要是IgG。
⑦如要進一步提純，則用第二峰再過DEAE—纖維素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脫，洗脫下來的蛋白液即為IgG。
也可以按以下操作方法進行：
①以18%硫酸鈉（W/V）提取一次，再以14%的硫酸鈉提取一次。
②將粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9%加入無水硫酸鈉，離心。再將上清按5%加入無水硫酸鈉，離心。將兩沉淀溶解、混合，在常水中透析過，再在生理鹽水中4℃透析，直至無SO4 2-為止。
③離心將上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
④過SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脫，收集洗脫液，取第二峰即為雞IgG。
二、IgM的分離與提純
1、材料
（1）血清
（2）葡聚糖凝膠G200
（3）洗脫液0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris－HCl 0.14Mol/L NaCl）
2、操作方法
選取2.50cm×90cm層析柱，用葡聚糖凝膠G200裝柱，平衡后，直接加血清樣品10ml或硫酸銨粗提制品，洗脫液洗脫，流速0.25ml/min，分管收集，測OD280值，*峰即為IgM。將*峰的數(shù)管混合，濃縮、鑒定。
三、IgA的分離與提純
1、材料與試劑配制
（1）DEAE52纖維素
（2）0.10Mol/L ZnSO4液
ZnSO4•；7H2O 2.88g
加水至1000.00ml
（3）飽和硫酸銨溶液
（4）10%EDTA—Na
（5）SephadexG200
（6）0.01Mol/L pH7.4PB液
（7）0.10Mol/L pH6.4PB液
（8）血清
2、操作方法
（1）取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液，調(diào)pH至7.0，室溫攪拌1h，離心去沉淀。
（2）于上清液中加入等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置30min或冰箱過。
（3）10000r/min離心10min，去上清。
（4）取沉淀溶于4ml10%EDTA－Na溶液中。
（5）生理鹽水中透析除鹽。
（6）過DE52柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脫蛋白（IgG）棄去。
（7）換用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脫，收集蛋白峰，即為IgA。
（8）再過SephadexG200柱，洗液為0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl），收集洗脫液測OD280值，取*峰即為純化IgA。
（9）透析、濃縮、鑒定。
四、分泌型IgA的分離與鑒定
1、材料與試劑
（1）初乳
（2）SephadexG200
（3）0.10Mol/L pH6.8PB液
（4）0.01Mol/L pH7.4PB液
（5）DEAE52
2、操作方法
（1）取初乳20ml，10 000rpm離心10min，棄去表面脂肪層及底部的沉淀物。
（2）取乳清過SephadexG200柱（柱規(guī)格為2.50cm×90cm），以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脫，*峰為IgA（含IgG）。
（3）收集乳液，于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
（4）將透析液濃縮至5mg/ml以上。
（5）過DE52層析柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脫，洗下蛋白峰為IgG，棄去。
（6）換用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS（0.10Mol/L NaCl）液洗脫，
收集洗脫液，即為較純的IgA液。
（7）必要時，可再過一次SephadexG200柱。
（8）濃縮，鑒定
五、禽IgA提取與純化
1、材料與試劑配制
（1）禽膽汁
（2）飽和硫酸銨溶液
（3）0.01Mol/L pH7.4PBS液
（4）0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）
（5）DEAE52-纖維素
2、操作方法
（1）取冷藏的膽汁3Ⅹml，緩慢滴加Ⅹml飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使成25%飽和硫酸銨液。4℃放置30min。
（2）3000r/min離心30min，去沉淀。
（3）取上清，加飽和硫酸銨液，使成35%的飽和度，4℃放置30min。
（4）3000r/min離心30min，棄上清。
（5）取沉淀，加0.85%NaCl液溶解，加飽和硫酸銨溶液，重復步驟3和4三次。
（6）將沉淀用0.85%NaCl液溶解，裝入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
（7）以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，過DEAE52纖維柱（20×250mm）。
（8）取透析樣品4ml（﹥20mg/ml蛋白濃度）加入層析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫。
（9）再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl濃度為0.30Mol/L）洗脫，收集洗脫液。
（10）濃縮洗脫蛋白液至20mg/ml，分裝，低溫冰箱保存。
六、IgE的分離與提純
1、材料與試劑
（1）血清
（2）飽和硫酸銨溶液
（3）洗脫液0.005Mol/L pH7.4PB液
0.025 Mol/L pH7.4PB液
0.01Mol/L pH7.4PBS液（0.14mol/L NaCl）
（4）DE52
（5）SephadexG150
2、操作方法
（1）取血清倍比稀釋后，加等量飽和（NH4）2SO4溶液，鹽析。
（2）離心取沉淀，溶于少量生理鹽水中，透析、除鹽。
（3）過DE52柱，以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脫，收集洗脫蛋白峰（IgG），棄去。
（4）換以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脫，洗下的蛋白峰主要是IgE。
（5）透析除鹽。
（6）過G150柱，以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液即為純化的IgE。
（7）濃縮、鑒定。