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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法檢測(cè)甲基化
更新時(shí)間：2013-07-27 瀏覽次數(shù)：2230
甲基化檢測(cè)方法（亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法）
甲基化是目前的研究熱點(diǎn)，就我所做的一點(diǎn)工作并其中一點(diǎn)心得，與大家分享。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?br />
*部分 基因組DNA的提取。
這一步?jīng)]有懸念，*可以購(gòu)買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。
此步重點(diǎn)在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過(guò)程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細(xì)節(jié)：
1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購(gòu)買市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒(méi)有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。
驗(yàn)證提取DNA的純度的方法有二：
1：紫外分光光度計(jì)計(jì)算OD比值；
2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
我傾向于第二種方法，這種方法*可以明確所提基因組DNA的純度，并根據(jù)Marker的上樣量估計(jì)其濃度，以用于下一步的修飾。
第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA
如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。
1：將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；
2：加5.5ul新鮮配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期間配制：
4：10mM對(duì)苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）
5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，zui終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會(huì)慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準(zhǔn)確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。
7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm開(kāi)始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，時(shí)間上很合適。
這一步細(xì)節(jié)：
1：基因組DNA的量不需十分，寧多勿少，因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失，且此方法修飾zui多可至4ug。
2：所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過(guò)關(guān)，既要快，又要。
3：亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收。
4：水浴達(dá)16小時(shí)，雖可以短至8小時(shí)，但后者修飾會(huì)有不*。