RNA干擾技術及其應用
更新時間：2013-04-15 瀏覽次數：1727
RNA干擾（RNA interference，RNAi）是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，它是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉錄后水平，又稱為轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。外源dsRNA 進入細胞后產生的小分子干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC具有結合和切割mRNA的作用而介導RNA干擾的過程。RNAi具有特異性和性。這種技術已經成為研究基因功能的重要工具，并將在病毒病、遺傳性疾病和腫瘤病的治療方面發(fā)揮重要作用。
近年來，RNA干擾的研究成為熱點，預測未來10年間zui有可能出重大成果的領域之一，并被《Science》評選為2002年度zui重要科技突破的*。RNAi是細胞本身固有的對抗外源基因及其侵害的一種自我保護現(xiàn)象，是雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平關閉相應序列及基因的表達使其沉默的過程。RNAi技術的應用領域已經從基因組學研究逐步擴展到醫(yī)學領域并作為基因治療手段。利用RNAi不僅能提供一種經濟、快捷、的抑制基因表達的技術手段，而且有可能在基因功能測定和基因治療等方面開辟一條新思路，因此包括動物醫(yī)學在內的諸多領域的應用也有非常廣闊的前景。
1.RNA干擾的發(fā)現(xiàn) 1995年，康乃爾大學的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）的par-1基因時，發(fā)現(xiàn)了一個意想不到的現(xiàn)象。她們本想利用反義RNA技術特異性地阻斷上述基因的表達，而同時在對照實驗中給線蟲注射正義RNA以期觀察到基因表達的增強，但得到的結果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這個意外以合理解釋。1998年，華盛頓卡耐基研究院的Fire和麻省大學醫(yī)學院的Mello在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應變得十分微弱，而經過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠特異性阻斷相應基因的表達，其抑制基因表達的效率比純化后的反義RNA至少高2個數量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。在1999年短短的一年間,發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物中細胞。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在ＲＮＡ干擾現(xiàn)象。
2.RNA干擾的作用機制 當病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應，其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，zui終將靶mRNA*降解。
RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因沉寂。所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。
RNAi干擾現(xiàn)象具有以下幾個重要的特征：①RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制；②RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA；③RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子（數量遠遠少于內源mRNA的數量）就能*抑制相應基因的表達，是以催化放大的方式進行的；④RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點;⑤dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內被Dicer酶切割為21 bp左右的siRNA，并由siRNA來介導mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡；⑥ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程?？赡苁?/span>Diecer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。
3.常用的RNAi的研究策略
3.1直接合成針對靶基因的siRNA（合成的是RNA,不是DNA），通過轉染（有用于siRNA轉染的試劑）的方法使之進入細胞內，參與到RNAi途徑，發(fā)揮使靶基因沉默的效應。這一方法受轉染效率的影響較大，而且能順利的進入RNAi途徑的效率怎么樣，還有待驗證。不過目前有不少基因的siRNA已經有商業(yè)產品，所以使用時買來就可以了，比較方便。
而且直接合成的siRNA可以進行小分子多肽等配體標記，可進行體內研究，注入體內后，通過配體的識別，被特定的細胞吸收，在特定的靶細胞內實現(xiàn)RNAi研究。
3.2構建shRNA的質粒表達載體shRNA的質粒表達載體，轉染細胞，在細胞內轉錄生成shRNA,利用細胞內的Dicer酶，生成相應的siRNA，發(fā)揮RNAi作用。
3.3構建shRNA的病毒表達載體 常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等，機制與質粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較高的特點，解決了用質粒載體轉染效率低的缺陷。
4.RNA干擾的應用 RNA干擾j8f12a.cn現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其在生物中存在的普遍性，以及RNAi作用機制和生物學功能的初步闡明，為RNAi的應用提供了理論基礎。RNAi目前已經在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉導等廣泛的領域里取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學領域包括動物醫(yī)學領域在內的應用有著廣闊的前景。
4.1 研究基因功能的新工具 由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。與傳統(tǒng)的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能*的工具。
4.2 病毒性疾病的治療 加州大學洛杉磯分校和加州理工學院的研究人員開發(fā)出使用RNAi技術來阻止艾滋病病毒進入人體細胞。這個研究小組設計合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5進入人體外周Ｔ淋巴細胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導siRNA進入細胞內產生了免疫應答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi還可應用于其它病毒感染如脊髓灰質炎病毒等，siRNA已證實介導人類細胞的細胞間抗病毒免疫，用siRNA對Magi細胞進行預處理可使其對病毒的抵抗能力增強。在zui近*約30個國家和地區(qū)散發(fā)或流行的嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，
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